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                活性污泥中細菌對聚丙烯酰胺的生物降解研究

                發布日期:2015-05-01 16:09:39
                活性污泥
                  聚丙烯酰胺(Polyacrylamide, PAM)是丙烯酰胺及其衍生物的均聚物和共聚物的統稱,為線性水溶性高分子的一種,親水性高,能以各種百分比溶于水,不溶于大多數有機溶劑。它是應用最廣泛的水溶性高分子化合物之一,并享有“百業助劑”之稱[1],不僅已廣泛應用在石油開采、水處理、紡織、造紙、制糖、選礦、醫藥、 建材、農業等領域,而且在食品、藥品以及整容等與人 們日常生活和人類健康相關的領域也都有應用。
                  
                  在我國,聚丙烯酰胺的消費現狀為:采油工業是 第一大用戶,占總需求量的80%左右,第二位是水處 理,約占9%,造紙占5%,礦山占2%,其他占3%。在 采油工業中,聚合物驅油3次采油技術已進入大面積工業化推廣應用階段[2]。聚合物干粉年注人量已達萬 噸以上,預計到2010年,我國石油開采行業PAM需 求量為10~ll萬t,占總需求量的活性污泥80%左右,其規模 在世界處于遙遙領先地位[3]。伴隨而來的是大量含有 一定濃度及保留一定黏度的聚合物產出水,大慶油田 有些采油廠采出水中PAM的濃度己經高達l 000 mg ? L-1以上[4]。含聚丙烯酰胺(PAM)污水中殘留單體丙烯 酰胺(AM)的毒性很大[5],如直接排放,將在環境中逐 漸積累,危害環境,然而現有工藝無法滿足處理要求, 需要對PAM降解的途徑和機理進行全面深入的研 究,尋找合適的處理方法。
                  
                  本文從勝利油田的活性污泥中初步篩選到3株 聚丙烯酰胺降解菌,通過探索性實驗篩選出適合微生 物降解聚丙烯酰胺的優化條件。
                  
                  l材料與方法l.l實驗儀器DSHZ-300多用途水浴恒溫振蕩器、SHP-150生化 培養箱、LDZX-50FAS立式電熱壓力蒸汽滅菌器、 YS100顯微鏡、721型分光光度計、pH計、紅外光譜儀 (AVATER360FT-IR)、高效液相色譜儀(Agilent1100)。 l.2培養基基礎培養基(g-L-1):蛋白胨5,牛肉膏l0,NaCi 5。 去離子水1 000 mL。
                  
                  降解培養基(g*L-1):聚丙烯酰胺0.3,葡萄糖2, NaNO31,KH2PO41.5,K2HPO41.5,MgSO4 0.5。去離子水 1 000 mL。
                  
                  1.3菌株的篩選和分離活性污泥中許多微生物接觸一段時間后才具備 降解抑制物的能力,因此需對污泥進行馴化。將100 mL勝利油田的活性污泥加到盛有1 000 mL的基礎培 養基的燒杯中,置于(35±1)C的恒溫槽中,用魚缸充 氣器進行曝氣。先培養活化3 d后,每72 h更換1次 混合液,逐步增加含聚污水的濃度(聚丙烯酰胺濃度: 50~500 mg.L-1),培養馴化45 d后進行細菌分離。
                  
                  用平板劃線法分離細菌,將平板置于37 C的生 化培養箱中培養48 h后,再挑取不同形態的菌落進 行平板劃線純化細菌。根據菌落形態和顯微鏡觀察結 果,重復劃線分離,直到得到純細菌。然后再對篩選出 的菌種進行生理生化鑒定。
                  
                  1.4分析方法1.4.1聚丙烯酰胺質量濃度測定采用濁度法。生物降解率!(%)的表達式為:!=(C0-Cl)/C0xl00%式中:C0表示降解前的聚丙烯酰胺含量,mg ? L-1 ; C1表 示降解后的聚丙烯酰胺含量,mg*L-1。
                  
                  1.4.2紅外光譜分析聚丙烯酰胺干粉和微生物降解產物,用光譜純 KBr壓片后進行紅外光譜分析。
                  
                  1.4.3高效液相色譜分析色譜條件:Agilent ZORBAX XDB-C18 柱(3.0 mm x250 mmx5 !m);流動相為Mili-Q水;流速為0.4 mL.min-1;紫外196 nm處監測;進樣量為50 !L。此方 法對丙烯酰胺的檢測靈敏度為ppb級[6]。
                  
                  2結果與討論2.1細菌的篩選和鑒定從勝利油田的活性污泥中篩選到3株聚丙烯酰 胺好氧降解菌,分別命名為AS-l、AS-2和AS-3。根 據形態觀察和生理生化鑒定,初步鑒定為:AS-l為脂 肪桿菌屬,AS-2為海球菌屬,AS-3為動性球菌屬。
                  
                  2.2細菌的生長曲線測定測定細菌生長曲線了解其生長繁殖規律,這對有 效地利用和控制細菌的生長具有重要的意義。在適宜 的條件下,培養細菌要經歷延遲期、對數期、穩定期和 衰亡期4個階段。
                  
                  采用濁度法分別測定了 AS-l、AS-2和AS-3以 及混合菌在降解培養基中的生長曲線,結果見圖1。 從圖中可以看出,3株菌和混合菌在前5 h內生長緩 慢,處于生長的延遲期。5 h后細菌濃度大大增加,開 始進入細菌的生長對數期。11 h后,細菌的生長又開 始趨向平緩,這時進人了穩定期,持續一定時間后,細 菌濃度開始減少,進人衰亡期。其中菌株AS-2的生長較快,細菌濃度較大,是優勢菌種。
                  
                  2.3單株菌和混合菌的降解能力比較環境污染物的降解有時可通過單株細菌完成,有 時也需要多株細菌間的協作來完成的。同時多株菌共 存可能存在協同作用,提高單株菌對降解物的降解效 果,也可能存在拮抗作用,降低單株菌對降解物的降 解效果。所以,將3株菌正交混合后在降解培養基中 培養,考察對聚丙烯酰胺的降解效果,結果見圖2。 6.5、7、7.5、8、8.5、9。在 35 ",140r.min-1 的恒溫搖床中振蕩培養5 d后測定聚丙烯酰胺的濃度。實驗結果 見圖4。
                  
                  從圖4可以看出,不同的初始pH值對聚丙烯酰 胺的降解有較大的影響。pH值在7#8之間時,聚丙烯 酰胺的降解效果較好。降低或增大pH值,聚丙烯酰 胺的降解率都減小。當pH=8時,聚丙烯酰胺的降解 率最高,達到33.29%。
                  
                  o 53 20 5 0 52 '—i '—_%/MVd iocoCOPBJl——(BAOln9y0 AS-1 AS-2 AS-3 AS-1,2 AS-1,3 AS-2,3 AS-1,2,3 Different combinations of bacterium圖2單株菌和混合菌的降解能力的比較 Figure 2 The comparison of degradation rates of singIe bacterium and mixed bacteria不同菌株對聚丙烯酰胺的降解能力存在差異,菌 株AS-2的降解效果最好,菌AS-1和AS-3對聚丙烯 酰胺的降解效果不明顯,并且菌AS-1和AS-3對菌 AS-2有明顯的拮抗作用?;旌吓囵B的降解效果都不如 單株菌AS-2的降解效果。所以菌AS-2為降解聚丙烯 酰胺的優勢菌,在后續的實驗中對其作深人研究。
                  
                  2.4菌AS-2降解聚丙烯酰胺的條件優化 2.4.1最佳反應時間的確定將菌AS-2接人250mL的降解培養基中,在37 ",140 ?min-1的恒溫搖床中振蕩培養,間隔一定的 時間測定聚丙烯酰胺的濃度。
                  
                  從圖3可以看出,在前5 d內,菌AS-2對聚丙烯 酰胺的降解效果明顯,在第5 d的時候,聚丙烯酰胺 的降解率達到40.51%。而后,隨著降解時間的延長, 聚丙烯酰胺降解率增長緩慢。這可能是菌AS-2的代 謝產物所致。由于過長的降解時間不但增加處理成 本,而且不利于實際應用。所以,選取菌AS-2降解聚 丙烯酰胺的最佳時間為5 d。
                  
                  2.4.2初始pH的確定不同的微生物有其最適宜的生長pH值范圍,同 一微生物在其不同的生長階段和不同的生理、生化過 程中,也要求不同的最適宜的pH值。將菌AS-2接人 降解培養基中,分別將pH值調為2、3、4、5、5.5、6、2.4.3溫度的確定將菌AS-2接人降解培養基中,溫度范圍為25# 55 ",pH=8,靜置培養4 d后測定聚丙烯酰胺的濃 度。 溫度對聚丙烯酰胺降解率的影響見圖 5。 當溫度 為30#45 "時,AS-2對聚丙烯酰胺的降解效果較好, 在40 "時,聚丙烯酰胺的降解效果達到最好,降解率 達到32.25%。繼續升高溫度,聚丙烯酰胺的降解率大 幅度下降。所以,40"為最佳降解溫度。
                  
                  2.4.4最佳碳源的確定分別選取了 NaHCO3、乙酸鈉、橄欖油、可溶性淀 粉、原油、葡萄糖、蔗糖為碳源,其含量均為2 g*L-1,25303540455055T emperature/C圖5溫度對降解率的影響 Figure 5 The effect of temperature on degradation ratespH為8,在37 C,140 r.min-1的恒溫搖床中振蕩培養 5 d后測定聚丙烯酰胺的含量。從圖6可以看出,碳源 為葡萄糖時,菌AS-2對聚丙烯酰胺的降解效果最 好,降解率達到40.73%,碳源為原油時,降解率較低, 為29.70%。但油田的含聚污水中同時也含有原油,所 以從實際應用考慮,選取原油為碳源。
                  
                  2.4.5最佳氮源的選擇分別選取了 NaNO;、尿素、硫酸銨、蛋白胨、NH4CI 為碳源,其含量均為lg.L-l,pH為8,在37C、140r. min-1的恒溫搖床中振蕩培養5d后測定聚丙烯酰胺的 含量。從圖7可以看出,氮源為NaN〇3時,菌AS-2對 聚丙烯酰胺的降解效果最好,降解率達到43.75%。 2.4.6碳源、氮源含量的確定分別考察了原油和硝酸鈉含量對菌AS-2降解 聚丙烯酰胺的影響(結果見圖8,圖9)。實驗表明,當 原油含量為2.5 g-L-1,硝酸鈉含量為1.4 g-L-1時,菌 AS-2對聚丙烯酰胺的降解效果最好,分別達到了 33.83%和 45.23%。
                  
                  050505054 3 3 2 2 1 1%/svd-M-loco!=:OPB!-ll——(扣 Aom€y-5 0 5 0 5 0 53 3 2 2 1 1%/sVJ jo SU0P2 PAOiy0L0.5l.01.52.02.53.03.54.0Crude oil content/g ? L-1圖8碳源含量對降解率的影響Figure 8 The effect of crude oiI content on degradation rates_L_Jq_L_lo9pmo^ EOO^EUItc,u itlo:}!?Iffe I D_l_IoJ。
                  
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                  _J_J€soonTb圖6碳源種類對降解率的影響Figure 6 The effect of different carbon sourced on degradation rates00004 3 2 1%/sv J JO SLI0--32 PAOS9y000005 4 3 2 1%/sVJ JO SU0P2 PAOiK00.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0NaN〇3 content/g ? L-1圖9氮源含量對聚丙烯酰胺的影響 Figure 9 The effect of NaN〇3 content on degradation rates^3l——(q031?
                  
                  D5J.N:9U0-I_ld9dces lr( 5s015 Itrc8VH53nt圖7氮源種類對降解率的影響Figure 7 The effect of different nitrogen sources on degradation rates3囷AS-2對聚丙烯酰胺結構的影響分別對聚丙烯酰胺降解前后的樣品進行了紅外 掃描(圖10、圖11)。從圖中可以看出,經過菌AS-2 降解后的聚丙烯酰胺的紅外光譜圖發生了明顯的變 化。降解后聚丙烯酰胺的譜圖中的3 300~3 500 cm-1 處附近-NH2的伸縮性振動特征吸收峰明顯變弱,說 明了微生物主要降解了聚丙烯酰胺側鏈上的酰胺基。 根據1 364 cm-1和920 cm-1附近出現新的吸收峰,可mAU8006004002000rvuocyU寸。:PZL 66S-I—I)()
                  
                  5012345678圖11丙烯酰胺標樣的高效液相色譜圖Figure 11 The HPLC picture of AM standard sample以確定體系中的羧基的存在。1 462 cm-1處的峰消失和 1082 cm-1處的峰明顯變寬變強,說明氨基可能從聚 丙烯酰胺側鏈上脫落下來成為游離的氨基。同時, 530"995 cm-1處出現的幾個強的吸收峰代表了芳香 化合物,可能是微生物的代謝產物。所以,可以推斷菌 AS-2主要降解了聚丙烯酰胺的側鏈,把酰胺基降解 成了羧酸和游離的氨基。
                  
                  4丙烯酰胺單體的測定聚丙烯酰胺本身基本無毒,但是它的單體,丙烯 酰胺(Acrylamide,AM)的毒性卻很強,它是神經系統致毒劑,對神經系統有損傷作用,中毒后表現為肌體 無力和運動失調等癥狀[7]。因此,在PAM的使用過程 中人們非常關注是否有單體釋放出來。本文用高效液 相色譜法考察了生化過程中是否有丙烯酰胺單體產 生(圖11、圖12)。
                  
                  從圖中可以看出,丙烯酰胺標樣的保留時間為 3.227 min,而降解后的PAM溶液的3個峰的保留時 間分別為1.902、2.715、2.929 min,均不在丙烯酰胺出 峰處。說明經生化處理后的PAM溶液中沒有丙烯酰 胺單體生成。用高效液相色譜檢測生化后的PAM溶 液,未檢測出單體丙烯酰胺。
                  
                  mAU500400 -30020010000圖12生化后PAM溶液的局效液相色譜圖 Figure 12 The HPLC picture of PAM after biodegradation5結論(1)從勝利油田的活性污泥中篩選出3株聚丙烯 酰胺降解菌,通過比較篩選出一株降解效果較好的菌 AS-2。研究了 AS-2對聚丙烯酰胺生物降解的最佳條 件。結果表明,當降解時間為5 d、pH=8、溫度為40 #、碳源為原油、氮源為NaNO;、原油和NaNO3的含量 分別為2.5、1.4 g,L-1時,AS-2對聚丙烯酰胺的降解 率達到45.23%。
                  
                  (2)分別對聚丙烯酰胺降解前后的樣品進行了紅 外掃描。經過菌AS-2降解后的聚丙烯酰胺的紅外光 譜圖發生了明顯的變化。經過紅外分析,可以推斷菌 AS-2主要降解了聚丙烯酰胺的側鏈,把酰胺基降解 成了羧酸和游離的氨基。結果表明,菌AS-2對聚丙 烯酰胺具有較強的生物降解功能。用高效液相色譜檢 測生化后的PAM溶液,未檢測出單體丙烯酰胺。
                 
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