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                一種吸附劑載體聚丙烯酰胺微球的合成及應用

                發布日期:2015-01-06 12:37:09

                反相懸浮聚合法,聚丙烯酰胺微球載體,低密度脂蛋白吸附劑

                用于低密度脂蛋白吸附劑聚丙烯酰胺微球載體的合成工藝、結構特性及吸附LDL的性能, 為進一步研發LDL吸附劑載體提供實驗依據。采用反相懸浮聚合法按一定的配方合成聚丙烯酰胺微球載體,通過 掃描電鏡、圖像分析儀、X光小角散射等手段對其結構特性(粒徑、孔徑等)進行表征;同時在微球上固定絲氨酰-天 冬氨酰#氨酸(SDE)三肽配體制成LDL吸附劑,通過體外靜態吸附對其吸附性能進行了初步研宄。結果表明微球 粒徑為142. 1 "m,孔徑為119. 8 nm,符合作為LDL吸附載體的需要;在交聯劑與單體總量一定的條件下,微球孔 徑隨著交聯劑用量的增加而減小;合成的聚丙烯酰胺微球對LDL的非特異性吸附很小,而在其上偶聯配體制成吸 附劑后,又表現出對LDL的特異性吸附。本實驗合成的聚丙烯酰胺微球是一種有效的LDL吸附劑載體。

                目前臨床上能影響血中LDL水平 類,一類是與遺傳有關的原發性因素, 蛋白血癥;另一類是因其它疾病引起& 繼發因素而致的LDL升高應以治療H 原發因素所致的LDL升高則通過降,
                l引言
                尚脂血癥尤其是低密度脂蛋白(Low density lipoprotein, LDL)導致動脈粥樣硬化是公認的事實 ,由此而引起的心、腦血管疾病嚴重危害人類的健 
                進行控制,但效果并不滿意。70年代以來,去除LDL 的血液凈化療法逐漸應用于臨床,其中的吸附劑吸 附法由于對LDL具有選擇性吸附,所以取得了較好 的療效。制備LDL吸附劑首先涉及的一個重要環節 就是吸附劑載體的選擇和合成。它的性質能影響吸 附劑在吸附選擇性以外的其它性能。一般來說,應用 于血漿的特異吸附劑載體必須具備如下性質:(1)滅 菌后其結構及化學性質不變或變化很小;(2)高黏稠 流體血漿的快速流動不引起聚集;(3)載體本身對血 漿成分的非特異性吸附很少;(4)由于機械作用原因 吸附劑載體破碎后不脫落出微粒;(5)要有足夠的吸 附面積;(6)必需有優良的血液相容性。根據前述要 求,本文采用反相懸浮聚合法合成具有一定粒徑和 孔徑的聚丙烯酰胺微球作為載體,以絲氨酰-天冬氨 酰#氨酸(SDE)負電性三肽(此三肽廣泛存在于 LDL受體配體結合域7個重復序列的羧基末端,對 LDL受體特異性識別LDL起著重要作用[1'2])作為 配體固定于其上制成LDL親和吸附劑,并初步研宄 了此吸附劑吸附LDL的性能。
                2材料和方法
                2.1實驗試劑與儀器
                丙烯酰胺(AAM),AR,天津市化學試劑研宄 所;亞甲基雙丙烯酰胺(MBA), BR,中國科龍
                精細化工廠;過硫酸鉀(KPS), AR,西安化學試劑 廠;四甲基乙二胺(TEMED),生化試劑,中國上海 前進化學試劑廠;司本~80( Span~80),上海市申隆制 藥廠;吐溫~80(Tween~80),上海市申隆制藥廠;甲 苯(Methylbenzene), AR,中國成都金山化工試劑 廠;氣苯(Chlorobenzene),AR,中國上海試劑一■廠; 戊二醛,AR,天津市華真特種化學試劑廠;1-乙基- 3~( 3-二甲基氨丙基)泰二亞胺(EDC), BR, ACR0S Oganics公司;SDE三肽,本實驗室合成。懸浮聚合 反應釜,本實驗室自備;圖像分析儀,中國科學院;X 射線衍射儀,PW1700, KRATKY狹縫系統,菲利浦 公司;日立牌X~650型掃描電鏡;THZ~82恒溫振蕩 器,常州國華電器有限公司;自動生化檢測儀,日本 島津。
                2. 2微球的制備及其粒徑和單分散指數的測定
                將溶有司本~80和吐溫~80的甲苯和氯苯混合 物(;油相)加入懸浮聚合反應II中,保持60 °C的反應 溫度,緩慢攪拌使加熱均勻,并通入氮氣5 min。將 引發劑溶液加進溶有AAM和MBA的水相中,并 加催化劑預引發反應2 min,然后將其立即加入至 60°C的反應釜中,調整攪拌轉速為200?300 rpm, 繼續用氮氣保護聚合反應。2 h后停止反應,產物用 蒸餾水反復沖洗并置于蒸餾水中備用。聚合體系的 配方見表1。 
                表1聚合體系的配方
                Table 1 The composition of reversed-phase suspension polymerization system
                Water phaseOil phaseDispersion[systemInitiate agent
                AAMMBAH2OM ethylbenzene ChlorobenzeneSpan 80Tween 80KPSTEMED
                (g)(g)(g)(ml)(ml)(g)(g)(G)(drop)
                9. 1611.06675112. f) 112.51. 350.450. 04093
                (18.4 : 1)
                Numerical ratio in the bracket is the mole ratio of AMM and MBA
                 
                將微球點樣至電鏡樣品臺上,自然干燥,表面噴 金,用掃描電鏡作形貌分析。將微球樣品在載玻片上 制樣,送至圖像分析室,選取500粒以上的樣品微球 作統計分析,返回統計樣本的粒徑數據集合,得到樣 本的平均粒徑(7))和單分散指數(MDI)。MDI按下 式求得[3]:
                U^ kLDi /( ZDl • LL»|
                i= 1i= 1i= 1
                式中:k為樣品中粒子總數;D,代表被測微球的粒 徑。最后用粒徑分布直方圖進一步表示樣本的粒徑 特征。
                2.3不同交聯度微球的制備及其孔徑的測定
                以2. 2節方法按表2的配方進行不同交聯度微 球的制備。
                用X光小角散射法測定各合成樣品的孔徑。 2.4 LDL吸附劑的制備及其吸附性能的測定
                參閱文獻[4]。
                3結果
                按表1配方合成的微球,其形貌率 圖la可知合成樣品微球之間分得很于 勻,很少有粘連的情況。圖lb顯示樣 的球形。微球的平均粒徑為111.S 1. 12,粒徑分布直方圖見圖2。常將IV 
                表2不同交聯度聚合體系的配方
                Table 2 The composition of reversed^phase suspension polymerization system with various degrees of crosslinking
                Water phaseOil phaseDispersion systemInitiate agent
                Experiment
                No.AAM
                (g)MBA
                (g)H2〇
                (g)Methyl benzene (ml)Chioro benzene (ml)Span 80 (g)Tween 80 (g)KPS
                (g)TEMED (drop)
                A8. 3761. 851 (9. 8: 1)75112. 5112. 51. 350.450. 04093
                B9. 1611.066 (18.4 : 1)75112. 5112.51.350.450. 04093
                C9.5030. 724 (26. 8 : 1)75112. 5112. 51.350.450. 04093
                D9.7860.441 (46. 0 : 1)75112. 5112.51.350.450. 04093
                * Numerical ratioin the bracket isthe mole ratio of AAMand MBA
                圖1聚丙烯酰胺微球電鏡形貌圖(a放大200倍,b放大1000倍)
                Fig 1 The SEM morphology of polyacrylamide beads( la X 200, lbX 1000) 
                為粒子單分散的標志|3],由此可知本實驗一次成球 未達到粒子單分散的要求;同時樣品的粒徑分布直 方圖也證實了這點,其柱形分布圖寬而低。為此,嘗 試使用了篩分的方法。在水流的作用下對樣品用標 準分樣篩進行篩分,結果表明大部分微珠在80? 120目與120?180目之間,對篩分所得的兩組樣品 用圖像分析儀統計粒徑,結果見圖3。篩分后兩個級 分的粒徑和單分散指數見表3。從圖3和表3可知, 篩分后兩個級分均達到粒子單分散的要求,按要求 (具體見討論)我們選擇平均粒徑為142. 1 pm的級 分作為吸附劑載體。
                表3樣品的篩分結果
                Table 3 The sieving result of sample polyacrviamiH^
                Fraction
                l(80-120mesh)87. 1
                2( 120-180mesh)142. 1
                用X光小角散射法測得的不同交聯I 如表4。
                表4 X光小角散射法測得的不同交聯度微球的孔徑 Table 4 The pore diameter of polyacrylamide bead with various
                degrees of crosslinking determined by small angle X^ay scattering
                SampleA(1 : 10)B(1 : 18)C( 1 : 27)D( 1 : 46)
                R( nm)67. 5119. 8129.5144. 3
                為了觀察不同交聯度對聚丙烯酰胺微球表面孔 徑的影響,本實驗根據表4做圖并擬合得到了交聯 度與聚丙烯酰胺微球表面孔徑的關系(見圖4)。
                在圖4中用A至D四點擬合可得一直線,由以 下方程表示:
                167. 87- 987. 5SX(X< 0. 1)(1) 
                 
                圖3樣品篩分后的粒徑分布圖
                Fig 3 Histograms of polyacrylamide bead distribution of sieved polyacrylamide bead
                Fraction 1: 80-120mesh; Fraction 2: 120-180mesh 
                以本實驗合成的具有一定粒徑和孔徑的聚丙烯 酰胺微球為載體,以絲氨酰-天冬氨酰I氨酸 (SDE)負電性三肽為配體固定于其上制成LDL親 和吸附劑,其對LDL和高密度脂蛋白(HDL)的吸 附性能如圖5所示。
                Adsorbent
                圖5兩種吸附劑對LDL和HDL的吸附率^±s, n= 4)
                A代表聚丙烯酰胺微球;B代表用戊二酸法制備的吸附劑;C代表用 EDC法制備的吸附劑
                Fig 5 The adsorption rate of two adsorbents for LDL and HDL
                (x±s,4)
                A: polyacrylamide bead; B adsorbent: ligands a BGP100 by glutaraldehyde; C adsorbent: ligands BGP100 by EDC
                4討論
                如前所述,吸附劑載體的性質能丨 吸附選擇性以外的其它性能,因此應:
                行選定。本研宄選擇聚丙烯酰胺微球作為載體是基 于其以下特點:不含生物多聚體,因而不易滋生微生 物;具有相對較好的pH穩定性(PH2-10)和化學穩 定性;具有的酰氨基在溫和反應條件下易于接上各 種類型的臂和/或配體[5];利用交聯度和/或共聚方 法,聚丙烯酰胺微球的孔徑、彈性和填柱的透過率可 按需要進行調節;由于丙烯酰胺共聚物微球的彈性 和疏水性可調,因而吸附LDL的強度遠遠大于吸附 其他的血漿蛋白[6];具有較好的親水性、優良的生物 相容性和很小的非特異性吸附[7];在121 °C蒸汽或 2. 5 Mrad下消毒不失去其原有功能[7];大孔徑聚丙 烯酰胺微球有足夠的吸附面積用于去除血中的 LDL。
                本實驗合成聚丙烯酰胺微球的最終粒徑為 142. 1 A/m,孔徑為119. 8 nm,這樣的結構使其無論 應用于血漿還是全血均有較好的血液相容性,且有 足夠的LDL吸附面積。因為微球孔徑在100?200 nm范圍內時,LDL可擴散通過微孔進入微球內部, 致LDL的吸附面積大大增加;而粒徑比LDL大的 成分如血細胞等卻被排除在微球之外,使血細胞等 成分與吸附材料的相互作用減少,材料獲得較好的 血液相容性[8'9]。
                由圖4和擬合公式(1)可知,在MBA與A AM 總量一定和MBA與AAM摩爾比小于0. 1的條件 下,隨著MBA與A AM摩爾比的減小,微球的孔徑 逐漸增大,也即MBA的用量越小,微球孔徑越大。 這是由于交聯劑用量增大時,微球內交聯點距變窄, 網絡空間變小,交聯密度增加,因而微球孔徑變小。 公式(為以后用類似方法合成聚丙烯酰胺微球,更 好地調控其孔徑以適應作為LDL吸附劑載體的需 要提供了有益的理論依據。
                通過對合成的聚丙烯酰胺微球氨乙基化、肼解、 堿水解等相應的處理后,再以戊二醛或1-乙基-3- (3-二甲基氨丙基)泰二亞胺為偶聯劑,輔以氰基硼 氫鈉催化(以戊二醛為偶聯劑時用),就可在很溫和 的條件下接上適當的伺隔臂”和配體(SDE)。這不 僅對制備LDL吸附劑十分有利,而且對在其上固定 其他配體從而制備相應的吸附劑同樣很有效。
                從圖5我們可以看出,無論被測血漿中是否存 在高濃度的Ca2+,未偶聯配體的聚丙烯酰胺微球對 LDL及HDL的吸附很少,而當固定上SDE酉己體制 成吸附劑后(無論是B吸附劑還是C吸附劑)其對
                LDL的吸附率明顯增高,與聚丙烯酰胺微球相比,P <0.05。此現象一方面說明本實驗合成的聚丙烯酰 胺微球非特異性吸附很小,另一方面也說明本聚丙 烯酰胺微球作為LDL特異性吸附劑的載體是有效 的。
                本實驗采用反相懸浮聚合法合成了具有一定粒 徑和孔徑的聚丙烯酰胺微球,并對相應工藝進行了 探討;同時在微球上固定SDE配體制成LDL吸附 劑,對此吸附劑吸附LDL性能進行了初步研究。本 微球雖然基本上符合作為LDL吸附劑載體的需要, 但仍有一定的缺點,如其強度不夠,在體外制成吸附 柱進行實驗時有可能引起聚集,這些需在以后實驗 中加以改進。
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