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                dna聚丙烯酰胺凝膠電泳

                發布日期:2014-08-22 15:54:43
                dna聚丙烯酰胺凝膠電泳的詳細介紹
                dna聚丙烯酰胺凝膠電泳一般使用的都是瓊脂糖凝膠電泳,電泳的驅動力靠dna聚丙烯酰胺凝膠電泳骨架本身的負電荷。 
                聚丙烯酰氨(PAGE)凝膠電泳用于蛋白質與寡糖核苷酸的分離。電泳的驅動力靠與蛋白質結合的SDS上所攜帶的負電荷。蛋白質電泳(一般指SDS-PAGE)根據蛋白分子量亞基的不同而分離蛋白。蛋白質亞基的電泳遷移率主要取決于亞基分子量的大小,電荷因素可以忽視。 
                 
                所以相同點就是樣品都是帶負電荷的,從負極向正極移動,移動的距離都和樣品的分子量有關。而且這兩個電泳體系可以互相交換使用。進行大分子蛋白質電泳時,可以考慮換用瓊脂糖凝膠,因為該體系孔徑大。相反,如果需要精確到各位數堿基的dna聚丙烯酰胺凝膠電泳也可以使用聚丙烯酰胺凝膠系統,因為使用該系統可以將相差一個堿基的兩條DNA鏈分開。 
                不同點首先是樣品不同。這個就不用多說了。其次是結果的觀察方法不同。dna聚丙烯酰胺凝膠電泳普遍使用EB做染料,在紫外燈下觀察;而蛋白電泳使用的考馬斯亮藍染色,還需要經過脫色步驟,不過觀察起來比較簡單。還有就是膠體系的差別,dna聚丙烯酰胺凝膠電泳通常是一膠跑到底,而蛋白質電泳則會有分離膠和濃縮膠之區別。 
                電泳中樣品移動的本質確實是樣品所攜帶的電荷。但是,區分這些條帶直接可以用分子量而無需使用電荷數,是因為這些樣品的電荷/分子量比都是恒定的了。以DNA分子為例,它在電泳中的移動是靠其骨架中磷酸所攜帶的負電荷來實現的,而這個磷酸分子又是每一個核苷酸中都有的,所以DNA分子所攜帶的負電荷數是由其核苷酸總數決定的。而且,dna聚丙烯酰胺凝膠電泳分子中核苷酸的組成動輒成百上千,在如此大的分子量面前,討論單個核苷酸之間分子量的差別就顯得毫無意義。這樣,DNA分子中負電荷的量就可以用DNA的分子量來代替,反過來,DNA的分子量也就可以用DNA分子所攜帶的電荷來代替(一句話,dna聚丙烯酰胺凝膠電泳的電荷/分子量比是恒定的)。 
                這在蛋白電泳中(特別是SDS-PAGE中)是一樣的。在SDS-PAGE中,SDS將蛋白質變性成直線分子并緊密包裹于其上,使得其所攜帶的電荷與蛋白分子量成了一定的比例,剩下的就和核酸電泳一樣了。 
                至于為什么核酸的橫著跑,蛋白豎著跑,個人認為最大的問題是蛋白制膠的過程導致的。蛋白制膠由于使用了兩種不同的凝膠系統,所以需要一個水平的分界面。這個分界面在配膠的過程中是依靠異丙醇在重力作用下的壓力下形成的。所以,一并就豎著跑了~~
                一.瓊脂糖水平平板凝膠電泳
                  
                  瓊脂糖通常用水平裝置在強度和方向恒定的電場下電泳。目前,一般實驗室多用瓊脂糖水平平板凝膠電泳裝置進行DNA電泳。
                  
                  瓊脂糖主要在DNA制備電泳中作為一種固體支持基質,其密度取決于瓊脂糖的濃度。在電場中,在中性pH值下帶負電荷的DNA向陽極遷移,其遷移速率由下列多種因素決定: 
                  1、 DNA的分子大小: 
                  線狀雙鏈DNA分子在一定濃度瓊脂糖凝膠中的遷移速率與dna聚丙烯酰胺凝膠電泳分子量對數成反比,分子越大則所受阻力越大,也越難于在凝膠孔隙中蠕行,因而遷移得越慢。 
                  2、 瓊脂糖濃度
                  一個給定大小的線狀DNA分子,其遷移速度在不同濃度的瓊脂糖凝膠中各不相同。DNA電泳遷移率的對數與凝膠濃度成線性關系。凝膠濃度的選擇取決于DNA分子的大小。分離小于0.5kb的DNA片段所需膠濃度是1.2-1.5%,分離大于10kb的DNA分子所需膠濃度為0.3-0.7%, DNA片段大小間于兩者之間則所需膠濃度為0.8-1.0%。 
                  
                   表 瓊脂糖濃度與DNA分離范圍
                  瓊脂糖濃度 /% 0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0
                  線狀DNA大小/kb 60-5 20-1 10-0.8 7-0.5 6-0.4 4-0.2 3-0.1
                    
                  3、 DNA分子的構象 
                  dna聚丙烯酰胺凝膠電泳分子處于不同構象時,它在電場中移動距離不僅和分子量有關,還和它本身構象有關。相同分子量的線狀、開環和超螺旋DNA在瓊脂糖凝膠中移動速度是不一樣的,超螺旋DNA移動最快,而線狀雙鏈DNA移動最慢。如在電泳鑒定質粒純度時發現凝膠上有數條DNA帶難以確定是質粒DNA不同構象引起還是因為含有其他DNA引起時,可從瓊脂糖凝膠上將DNA帶逐個回收,用同一種限制性內切酶分別水解,然后電泳,如在凝膠上出現相同的DNA圖譜,則為同一種DNA。 
                  
                  4、 電源電壓 
                  
                  在低電壓時,線狀DNA片段的遷移速率與所加電壓成正比。但是隨著電場強度的增加,不同分子量的DNA片段的遷移率將以不同的幅度增長,片段越大,因場強升高引起的遷移率升高幅度也越大,因此電壓增加,瓊脂糖凝膠的有效分離范圍將縮小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率達到最大,所加電壓不得超過5v/cm。 
                  
                  5、嵌入染料的存在 
                  
                  熒光染料溴化乙啶用于檢測瓊脂糖凝膠中的DNA,染料會嵌入到堆積的堿基對之間并拉長線狀和帶缺口的環狀DNA,使其剛性更強,還會使線狀DNA遷移率降低15%。 
                  
                  6、 離子強度影響 
                  
                  電泳緩沖液的組成及其離子強度影響DNA的電泳遷移率。在沒有離子存在時(如誤用蒸餾水配制凝膠),電導率最小,DNA幾乎不移動,在高離子強度的緩沖液中(如誤加10×電泳緩沖液),則電導很高并明顯產熱,嚴重時會引起凝膠熔化或DNA變性。 
                  
                  對于天然的雙鏈DNA,常用的幾種電泳緩沖液有TAE[含EDTA (pH8.0)和Tris-乙酸],TBE(Tris-硼酸和EDTA),TPE(Tris-磷酸和EDTA),一般配制成濃縮母液,儲于室溫。
                  
                  瓊脂(糖)電泳常用緩沖液的pH在6-9之間,離子強度為0.02-0.05。離子強度過高時,會有大量電流通過凝膠,因而產生熱量,使凝膠的水份量蒸發,析出鹽的結晶,甚至可使凝膠斷裂,電流中斷。常用的緩沖液有硼酸鹽緩沖液與巴比妥緩沖液。為了防止電泳時兩極緩沖液槽內pH和離子強度的改變,可在每次電泳后合并兩極槽內 的緩沖液,混勻后再用。
                  
                  
                  二.聚丙烯酰胺垂直板凝膠電泳(PAGE; polyacrylamide gel electrophoresis)
                  
                  聚丙烯酰胺凝膠采用垂直裝置進行電泳。聚丙烯酰胺分離小片段DNA(5-500bp)效果較好,具有分子篩和電泳的雙重作用,其分辯力極高,甚至相差1bp的DNA片段就能分開。聚丙烯酰胺凝膠電泳很快,可容納相對大量的dna聚丙烯酰胺凝膠電泳,但制備和操作比瓊脂糖凝膠困難。
                  
                  聚丙烯酰胺凝膠電泳適宜分離鑒定低分子量蛋白質、小于1Kb的DNA片段和DNA序列分析.其裝載的樣品量大,回收DNA純度高.長度僅相差0.2%(即500bp中的1bp)的核苷酸分子即能分離.
                  
                  聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺單體,在催化劑TEMED(N,N,N,N'一四甲基乙二胺)和 過硫酸銨的作用下,丙烯酰胺聚合形成長鏈,聚丙烯酰胺鏈在交聯劑,N,N'一亞甲 雙丙烯酰胺參與下,聚丙烯胺鏈與鏈之間交叉聯接而形成凝膠.
                  聚丙烯酰胺凝膠孔徑的大小是由丙烯酰胺的濃度決定的,不同濃度丙烯酰胺和DNA的 有效分離范圍見表2.
                  
                  丙烯酰胺(%) 有效分離范圍(bp) 溴酚蘭* 二甲苯青* 
                  
                   3.5 100~2000 100 460 
                   5.0 80~500 65 260 
                   8.0 60~400 45 160 
                   12.0 40~200 30 70 
                   15.0 25~150 15 60 
                   20.0 10~100 12 45 
                  *表中給出的數字為與指示劑遷移率相等的雙鏈DNA分子所含堿基對數目(bp).
                  
                  根據分離dna聚丙烯酰胺凝膠電泳片段的大小及需凝膠的容積,配制聚丙烯酰胺凝膠.
                  
                  1.按要求裝配好垂直電泳板,兩塊玻璃板的兩側及底部用1%的瓊脂 糖封邊,防止封閉不嚴而使聚丙烯酰胺液漏出.
                  
                  2.將裝好的玻璃電泳板傾斜成45~60℃角.
                  
                  3.按表3配制所需%濃度凝膠的毫升數.
                  
                  4.加入TEMED后,立即混勻,緩緩倒入兩玻璃板間的膠床中,直到液 體接近溢出時為止.
                  
                  5.立即插入適當的梳子,密切注意防止梳齒下產生氣泡,用一有力 的夾將梳子夾在一邊的玻璃板上,然后將玻璃板斜靠在物體上,使 成10°角,可減少液體泄漏的機會.
                  
                  6.室溫聚合一小時后,將玻璃板插入電泳槽中,上緊,倒入0.1XTBE 緩沖液.
                  
                  7.小心取出梳子,立即用緩沖液沖洗加樣孔,因為梳子取出后,梳 子上吸附的及凝膠頂部未聚合的丙烯酰胺會流入加樣孔內聚合,產 生不規則的表面,將導致以后DNA電泳帶型不規則.
                  
                  8.將DNA樣品與適量的載樣緩沖液混勻后,加到樣品孔內,加樣時不 要產生氣泡.
                  
                  9.接好電極,電壓為1-8V/cm,進行電泳.
                  
                  10.根據指示劑遷移位置來判定是否終止電泳.
                  
                  11.電泳畢,切斷電源,棄去電泳儀,取出膠床板,小心移去一塊玻 璃板,讓凝膠吸附在另一塊玻璃板上.浸入含0.5ug/ml的溴化乙錠溶 液中,15~30min后取出水洗紫外儀下觀察結果.
                  
                  12.聚丙烯酰胺凝膠電泳只能檢出>10ng以上量的DNA條帶.要求更高 的靈敏度,可用銀染.
                  
                 dna聚丙烯酰胺凝膠電泳濃度的選擇
                根據所分離蛋白質的相對分子質量范圍選擇最適凝膠濃度,5%的凝膠最適于分離蛋白質的相對分子質量范圍是25000~200000,10%的凝膠最適于分離蛋白質的相對分子質量范圍是10000~70000,3.33%的凝膠可用于分離相對分子質量更高的蛋白質。
                【基本原理】
                隨著蛋白質分離技術的發展,人們已將聚丙烯酰胺凝膠電泳引用到核酸研究上。使用2.5%的聚丙烯酰胺凝膠電泳,可以依次將4s tRNA、5sRNA、mRNA及16、18、23、26s的rRNA分開。電泳分離后,再用次甲基藍染色。由于4s的tRNA及5sRNA分子量較小,當電泳時間太長或膠條太短時,很易泳出膠條之外,如果需要對它們專門研究,應換用5%的聚丙烯酰胺凝膠。
                對于分子量較大的樣品,如大分子核酸、病毒等一般可采用膠中孔徑較大的瓊脂糖凝膠進行電泳分離。
                【操作方法】
                1、聚丙烯酰胺凝膠制備
                (l)裝板:先將玻璃板和1mm墊條徹底洗凈、晾干 長玻璃和短玻璃之間兩測放入1mm墊條,把長玻璃和短玻璃及墊條對齊,用透明膠帶密封兩測及底邊。
                (2)配膠(2.4%)①:凝膠灌注和聚合 取 4ml 制膠貯存液(15%丙烯酰胺-7.5%雙丙烯酰胺混合液 試劑1),12.27ml水及 8.33ml 3E緩沖液(試劑2)混勻,放在真空于操器中抽去制膠貯存液中的空氣,待液體沸騰30秒后,取出,加入 0.2ml 10%TEMED溶液和 0.2ml 10%過硫酸銨溶液,再混勻。立即將此液灌到已封閉的玻璃板間,使玻璃板與平面成 45°角放置,后再小心地加上 3-5mm 高度的水層覆蓋在膠的表面。自加入過硫酸銨起,到水封為止,全部操作應不超過 20min。室溫下任其自然聚合,當天使用。該膠板也可在室溫下放置過夜后使用。
                制備5%膠的步驟,除去應取 8.33ml 制膠貯存液, 7.94ml水及 8.33ml 3E及緩沖液外,以下各步皆同上,只是因5%膠更易聚合,所以動作應更迅速。5%膠柱應于當日制作,當日使用(tRNA于此膠中每小時泳動2cm)。
                2、加樣:用濾紙條吸去膠柱上面的覆蓋水層,將膠板的透明膠帶取下,固定于電泳槽中,向槽中灌入電極緩沖液(試劑3)。 
                取10µL樣品溶液,再加入 2µL 0.2g/L的溴酚藍指示劑,混勻后,用微量注射器將含有指示劑的樣品蔗糖溶液小心地轉移,加到膠板頂端的加樣槽中。取已知的樣品作為標準,與未知樣品一起泳動,用以幫助鑒定未知樣品分子量大小。
                3、電泳:樣品加入后,上槽接負極,下槽接正極,打開電流儀進電泳。
                電泳條件:10一15V/cm,本實驗所需電壓為60-100V。溴酚藍指示劑區帶移動到距膠板下端約l厘米處,停止電泳。
                4、染色與固定:電泳結束后,將兩塊玻璃板剝開,小心將膠取出放入培養皿,加入10ml 1M醋酸固定20min,再放入次甲基藍染色液內染色4h左右。然后在蒸餾水中浸泡脫色,不斷地更換蒸餾水,直至膠板背景洗凈,然后將膠板浸在7%醋酸中固定。
                5、測量、繪畫。
                【材料與試劑】
                (1)制膠貯存液(15%丙烯酰胺-7.5%雙丙烯酰胺混合液):稱取7.5g丙烯酰胺,0.375g 雙丙烯酰胺溶于50ml水中。
                (2)3E 緩外液(0.12M Tris-0.06M 醋酸鈉-0.003M EDTA,pH7.4 緩沖液)。
                稱取14.54g Tris, 8.2g 醋酸鈉,1.1g EDTA溶于水中,用冰醋酸調至pH7.4,稀釋到1000ml。
                (3)聚丙烯酰胺電泳電極緩沖液(O.004M Tris-0.02M 醋酸鈉-O.001M EDTA,pH7.4緩沖液)。
                (4)蔗糖溶液:40%(W/V)蔗糖水溶液。
                (5)0.2%次甲基藍染色液:0.2g次甲基藍溶于100ml 0.2M 醋酸-0.2M 酣酸鈉溶液中。
                (6)0.02%溴酚藍指示劑。
                (7)1M醋酸溶液。
                (8)瓊脂糖(粉末,A.R.)。
                (9)10%TEMED。
                (10)10%過硫酸銨。
                (11)7%醋酸。
                (12)核糖核酸樣品溶液:實驗四所得RNA溶液或1.5mg 酵母RNA溶于是1ml 40%蔗糖水溶液中配制而成。
                【實驗器材】
                ①垂直板型電泳槽及配件;②直流穩壓電源;③白瓷板;④透明膠帶;⑤日光燈;⑥微量注射器;⑦細長頭的滴管;⑧培養皿。
                凝膠電泳(英語:Gel electrophoresis)或稱膠體電泳 是一大類技術,被科學工作者用于分離不同物理性質(如大小、形狀、等電點等)的分子。凝膠電泳通常用于分析用途,但也可以作為制備技術,在采用某些方法(如質譜(MS)、聚合酶鏈式反應(PCR)、克隆技術、DNA測序或者免疫印跡)檢測之前部分提純分子??煞譃榄傊呛途郾0纺z電泳、 脈沖電場凝膠電泳。
                凝膠電泳的原理比較簡單。當一種分子被放置 在電 場當 中時 , 它們 就會 以一定 的速 度移向適當的電極 , 這種電泳分子在電場作用下的遷移速度 , 叫做電泳的遷移率。它同電場的強度和電泳分子本身所攜帶的凈電荷數成正比。也就是說 ,電場強度越大、電泳分子所攜帶的凈電荷數量越多 ,其遷移的速度也就越快 , 反之則較慢。由于在電泳中使用了一種無反應活性的穩定的支持介質 , 如瓊脂糖凝膠和聚丙 烯酰胺 膠等 , 從而降低了對流運動 , 故 電泳 的遷移率又是同分子的摩擦系數成反比的。已知摩 擦系數 是分 子的大 小、極性及介質 粘度 的函數 , 因此根據分子大小的不同、 構成或形狀的差異 , 以及所帶的凈電荷的多少 , 便可以通過電泳將蛋白質或核酸分子混合物中的各種成分彼此分離開來。在生理條件下 ,核酸分子的糖- 磷 酸骨架中的磷酸基 因 呈離子狀態 ,從這種意義上講 ,D N A 和 R N A 多核苷酸鏈可叫做 多聚 陰離 子 ( P ol yani o n s ) 。因 此 , 當核 酸分 子 被放 置在 電場中時 , 它們就會向正電極的 方向遷 移。由 于糖- 磷酸 骨架 結構 上的重 復性 質 , 相同 數量 的雙鏈 D N A 幾乎具有等量的凈電荷 , 因而 它們 能以 同樣 的速 度向 正電 極 方向 遷移。 在一 定的電場強度下 , D N A 分子的這種遷移速度 , 亦即電泳的遷移率 , 取決于核酸分子本身的大 小和構型 , 分子量較小的 D N A 分子比分子量較大的 D N A 分子遷移要快些。這就是應用凝膠電泳技術分離 D N A 片段的基本原理。
                瓊脂糖 ( Agarose ) 是一種線性多糖聚合物 , 系從紅色海藻產物瓊脂中提取而來的。當瓊脂糖溶液加熱到沸點后冷卻凝固便會形成良好的 電泳介 質 , 其密 度是由 瓊脂 糖的濃 度決 定的。經過化學修飾的低熔點 (LMP) 的瓊脂糖 , 在結構上比較脆弱 , 因此在較低的溫度下便會熔化 , 可用于DNA片段的制備電泳。
                聚丙烯酰胺凝膠主要有兩種方式 : 一是用于分離和純化雙鏈 D N A 片段的非變性聚丙烯酰胺凝膠。在未變凝膠中分離 D N A 的缺 點是 dna聚丙烯酰胺凝膠電泳 的 遷移 率受堿 基組 成和序 列的 影響。由于無法得知未知 D N A 的遷移是 否反 常 , 故不能用未變性的聚丙烯酰胺凝膠 電泳 確定雙鏈 D N A 的大小。二是用于分離及純化 單鏈 D N A 片 段的 變性聚 丙烯 酰胺凝 膠。這 類聚丙烯酰胺凝膠是在核苷酸堿基配對抑制劑 ( 尿素或甲酰胺 ) 的存在下聚合而成 , 變性DNA的移動速度同其堿基組成及序列幾乎完全無關 , 故可用于分離及純化單鏈DNA片段和DNA測序等。
                瓊脂糖主要在DNA制備電泳中作為一種固體支持基質,其密度取決于瓊脂糖的濃度。在電場中,在中性pH值下帶負電荷的DNA向陽極遷移,其遷移速率由下列多種因素決定:
                DNA的分子大小
                線狀雙鏈DNA分子在一定濃度瓊脂糖凝膠中的遷移速率與DNA分子量對數成反比,分子越大則所受阻力越大,也越難于在凝膠孔隙中蠕行,因而遷移得越慢。
                瓊脂糖濃度
                一個給定大小的線狀DNA分子,其遷移速度在不同濃度的瓊脂糖凝膠中各不相同。DNA電泳遷移率的對數與凝膠濃度成線性關系。凝膠濃度的選擇取決于DNA分子的大小。分離小于0.5kb的DNA片段所需膠濃度是1.2-1.5%,分離大于10kb的DNA分子所需膠濃度為0.3-0.7%,DNA片段大小間于兩者之間則所需膠濃度為0.8-1.0%。
                DNA分子的構象
                DNA分子處于不同構象時,它在電場中移動距離不僅和分子量有關,還和它本身構象有關。相同分子量的線狀、開環和超螺旋DNA在瓊脂糖凝膠中移動速度是不一樣的,超螺旋DNA移動最快,而開環雙鏈DNA移動最慢。如在電泳鑒定質粒純度時發現凝膠上有數條DNA帶難以確定是質粒DNA不同構象引起還是因為含有其他DNA引起時,可從瓊脂糖凝膠上將DNA帶逐個回收,用同一種限制性內切酶分別水解,然后電泳,如在凝膠上出現相同的DNA圖譜,則為同一種DNA。
                電源電壓
                在低電壓時,線狀DNA片段的遷移速率與所加電壓成正比。但是隨著電場強度的增加,不同分子量的DNA片段的遷移率將以不同的幅度增長,片段越大,因場強升高引起的遷移率升高幅度也越大,因此電壓增加,瓊脂糖凝膠的有效分離范圍將縮小。要使大于2kb的DNA片段有效分離所加電壓不得超過5V/cm。
                嵌入染料的存在
                熒光染料溴化乙啶用于檢測瓊脂糖凝膠中的DNA,染料會嵌入到堆積的堿基對之間并拉長線狀和帶缺口的環狀DNA,使其剛性更強,還會使線狀DNA遷移率降低15%。
                離子強度影響
                電泳緩沖液的組成及其離子強度影響DNA的電泳遷移率。在沒有離子存在時(如誤用蒸餾水配制凝膠),電導率最小,DNA幾乎不移動,在高離子強度的緩沖液中(如誤加10×電泳緩沖液),則電導很高并明顯產熱,嚴重時會引起凝膠熔化或DNA變性。
                對于天然的雙鏈DNA,常用的幾種電泳緩沖液有TAE[含EDTA (pH8.0)和Tris-乙酸],TBE(Tris-硼酸和EDTA),TPE(Tris-磷酸和EDTA),一般配制成濃縮母液,儲于室溫。
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